Bioimpressão 3D multicelular usando microfluídica para a engenharia de tecido cardíaco vascularizado
Um grupo de pesquisadores da Itália com colaborações da Polônia, Egito e Israel, publicou um belíssimo trabalho na Scientific Reports de tecido cardíaco vascularizado usando bioimpressão de células endoteliais, iPSC derivadas de cardiomiócitos e hidrogel.
O desenvolvimento de tecido cardíaco funcional com propriedades biológicas e mecânicas específicas é um dos maiores desafios no contexto da engenharia de tecidos.
Atualmente, uma das mais avançadas tecnologias utilizadas na fabricação de tecidos de engenharia baseia-se em sistemas de impressão 3D. Em particular, a bioimpressão tem ganhado atenção da comunidade científica, porque permite a deposição simultânea de células e biomateriais em camadas, formando estruturas heterogêneas bem organizadas capazes de mimetizar as estruturas dos tecidos biológicos. Assim, a bioimpressão pode ter a capacidade de apoiar e desenvolver o verdadeiro potencial terapêutico das células-tronco, que desempenham um papel cada vez mais importante na medicina regenerativa.
Neste estudo, impulsionado pela necessidade de fabricar modelo avançado de tecido cardíaco, os pesquisadores desenvolveram uma abordagem inovadora que consiste em construções heterogêneas, multicelulares, compostas de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) e cardiomiócitos derivados de células pluripotentes induzidas (iPSC - CMs ). As células foram encapsuladas dentro de cadeias de hidrogel contendo alginato e PEG-Fibrinogênio (PF) e extrudadas através de uma cabeça de impressão microfluídica personalizada (MPH) que permite precisamente adaptar sua deposição espacial 3D, garantindo uma alta fidelidade de impressão e resolução.
A figura mostra as principais etapas da bioimpressão de células iPSCs e endoteliais.
O grupo conseguiu um tecido cardíaco tridimensional composto de CMs derivadas de iPSC com um elevado índice de orientação imposto pelas diferentes geometrias definidas e formas semelhantes a vasos sanguíneos geradas pelas HUVECs que, como demonstrado pelo enxerto in vivo, suportam melhor a integração do tecido cardíaco modificado com vasculatura do hospedeiro.
Os resultados obtidos neste estudo fornecem importantes avanços no campo da geração de tecido cardíaco funcional in vitro utilizando a tecnologia de bioimpressão. IPSCs de murino - da mesma forma células-tronco embrionárias - geralmente são cultivadas em uma camada de MEF para evitar a diferenciação. Esta característica representa uma limitação importante para obter culturas puras de iPSCs. As iPSCs podem ser cultivadas em hidrogéis 3D de PEG-fibrinogênio (PF) retendo sua pluripotência.
As colônias de iPSC cultivadas em MEF e aquelas cultivadas em PF não mostraram diferenças morfológicas ou expressão diferente dos marcadores de células-tronco Oct4, Sox2 e Nanog. No entanto, a distribuição celular em construções a granel foi não homogênea devido à migração da iPSC para a zona externa dos hidrogéis. Essa é uma desvantagem típica dos hidrogéis volumosos com células embutidas no volume do núcleo da amostra, sempre sofrendo com a falta de oxigênio e nutrientes (limitados pela difusão molecular). Para superar este problema, neste trabalho os pesquisadores primeiramente imprimiram iPSCs indiferenciadas dentro de estruturas porosas compostas de fibras paralelas para eliminar problemas relacionados à difusão, obtendo um biossistema de cultura homogêneo que garante um suprimento preciso de nutrientes em todas as áreas da estrutura 3D.
Para avaliar a organização dos dois tipos de células em amostras multi-celulares biomédicas, foi realizada a análise de imunofluorescência após 7 dias de cultura. Curiosamente, HUVEC desenvolveu grandes estruturas semelhantes a endotelial (ou seja, monocamada de células) com um diâmetro de cerca de 100 μm, independentemente da sua organização espacial. Mais notavelmente, o scaffold impresso com Janus e a geometria 4: 2: 4 (4 camadas de iPSC, 2 camadas de HUVECs e 4 camadas de iPSCs) promoveu maior homogeneidade da distribuição HUVEC na superfície da fibra em comparação com a geometria 2: 2: 2: 2: 2 (Fig. 6a), sem apresentar áreas descelularizadas no perímetro das fibras.
Surpreendentemente, a CM derivada de iPSC não formou nenhuma organização funcional nas três estruturas bioimpressões multicelulares (semelhante à observada no caso da bioimpressão única de CM derivada de iPSC. Isso pode ser explicado em termos de tempo de cultura muito curto e formulação do meio para a co-cultura dos dois tipos de células: na verdade, ambos exigem fatores de crescimento específicos que no meio de cocultura empregado foram diluídas, sendo possivelmente inadequada para apoiar a organização / funcionalidade do CM.
Para provar uma vantagem real da abordagem de bioimpressão multicelular apresentada na montagem de construções mais funcionais para engenharia / modelagem de tecido cardíaco, as amostras foram implantadas in vivo por via subcutânea em camundongos NOD-SCID.
Em particular, cinco construções diferentes foram implantadas:
i) CM derivada de iPSC em hidrogéis a granel;
ii) CM derivada de iPSC em construções bioprintadas 3D;
iii) Janus (1 camada de iPSC e 1 camada de HUVEC);
iv) 4: 2: 4 e
v) 2: 2: 2: 2: 2.
(i) e ii) foram utilizados como controles. Todas as amostras foram pré-cultivadas in vitro durante 7 dias e depois enxertadas in vivo. Os implantes foram explantados duas semanas depois e analisados por imunofluorescência, FACS e qRT-PCR. Como mostrado na figura acima, foi encontrada uma vascularização melhorada nos casos de estruturas multi-celulares bioprintadas em comparação com os dois controlos desprovidos de células endoteliais (i.e. CMs a granel e CMs 3D bioprintados).
Curiosamente, um número particularmente abundante de vasos sanguíneos foi encontrado dentro das construções de Janus implantadas. Isto foi ainda confirmado por análises de imunofluorescência em que se evidenciava a formação de capilares vasculares ramificados e uma maior organização e orientação dos MCs.
Mais notavelmente, observamos que jo modelo janus constrói rede vascular bem desenvolvida de origem humana (originada por HUVECs e univocamente diferenciada com coloração humana Lamin A / C) com a do hospedeiro integrada, razoavelmente favorecida pela sinalização parácrina exercida pelas HUVECs localizadas nos implantes .
Finalmente, a orientação dos cardiomiócitos (CM) derivados de iPSC também foi estudada para todas as amostras revelando que a técnica de bioimpressão 3D pode ser usada para direcionar efetivamente o alinhamento de CM com uma melhoria significativa na organização geral da célula.
Curiosamente, como mostrado nos gráficos polares, o modelo Janus exibe a distribuição mais nítida (intervalo de ângulo entre -10 ° e + 10 °) entre as geometrias testadas, revelando uma interação benéfica entre HUVECs e CMs na organização de tecidos quando bioimpressa com organização definida.
Para quem tiver interesse, o trabalho completo - A multi-cellular 3D bioprinting approach for vascularized heart tissue engineering based on HUVECs and iPSC-derived cardiomyocytes - está no link a seguir: https://www.nature.com/articles/s41598-018-31848-x
Janaina Dernowsek, Ph.D.
Bióloga Geneticista e Pesquisadora na área de Biofabricação e Bioimpressão de Tecidos.
Pesquisadora associada ao Centro de Tecnologia da Informação Renato Archer, INCT - Regenera e UNIFESP. Idealizadora dos projetos BioEdTech e Bio3Data para a Bioimpressão de tecidos. Desenvolvedora do site e do blog www.biofabricacao.com.
